卵泡的生长

卵泡的生长开始于始基卵泡脱离静息状态，从人胚胎第4~6个月卵巢形成一直持续到卵巢功能的终末期。虽然一些研究人员已经提出，先形成的卵泡先发生排卵，但更多的研究提示静息卵泡过渡到生长阶段更可能是一个随机事件，与卵泡发育过程中形成的时序无关。

卵泡生长的开始以形态学的变化为特征，包括颗粒细胞形状从扁平变为立方形,颗粒细胞增殖，卵母细胞增大以及透明带的形成。扁平颗粒细胞向立方形的转化促使其功能的转变,包括某些功能mRNA(如卵泡抑素mRNA)的表达。颗粒细胞增殖与立方化进一步促进卵母细胞直径的增加。人类卵母细胞直径的第一次显著增加时发现最大卵泡截面上有15个颗粒细胞。卵母细胞的生长伴随着透明带的形成。随后，卵母细胞的生长和卵泡直径的增加呈正相关，直到卵母细胞形成平均直径达到80μm 的次级卵泡为止。此时卵泡直径110~120μm，并具有大约600个颗粒细胞。卵泡增长至这一大小时，卵母细胞的生发泡达到平均26~27um 的最大直径。当卵泡继续扩张并压缩周围基质形成卵泡外膜,前卵泡膜细胞在颗粒细胞分泌信号的募集下向卵泡外的基质迁移，颗粒细胞分泌的信号包括 Kit 配体和 IGF-1等,从卵母细胞分泌的信号包括FGF2、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、GDF-9和BMP-15也促进卵泡膜细胞迁移和增殖。随着次级卵泡的形成,颗粒细胞表达FSH、雌激素和雄激素受体，并通过缝隙连接紧密相连。卵泡膜的形成与卵泡的血液供应的发展相关,来自动脉的血供在邻近卵泡基底膜处形成环状毛细血管网络。同时，卵泡膜细胞表达LH受体并获得合成类固醇激素的能力。此后次级卵泡组成窦前卵泡池， FSH依赖的卵泡从窦前卵泡池中募集进入下一阶段,大部分卵泡通过闭锁而丢失。

(一)卵母细胞生长

次级卵泡生长的一个重要组成部分在于卵母细胞的分化和生长。生长中的卵母细胞代谢活跃,可以合成丰富的mRNA和蛋白质以支持早期胚胎着床前的生长和发育。周围颗粒细胞直接通过跨透明带突触与卵母细胞表面形成缝隙连接，进行营养素、生长因子和其他分子的双向转运，精密调节卵母细胞的生长。卵母细胞的生长过程中，通过透明带蛋白的积极合成、分泌、组装,逐渐形成成熟的透明带;部分细胞器的数量逐渐增加,特别是线粒体,在完全成熟的人卵母细胞中线粒体数量可达到大约有40万个;相反，部分细胞器在卵母细胞成熟过程中逐渐丢失，包括在卵原细胞中存在的中心粒。除了数量的变化，细胞器的分布随着卵母细胞发育成熟过程而发生变化，例如线粒体、内质网和高尔基复合体在紧邻生发泡区域逐渐聚集。卵母细胞在生长过程中逐渐获得减数分裂的能力，虽然具体机制尚不清楚，但只有在卵母细胞体积达到临界大小后才获得此能力。具有减数分裂能力的卵母细胞具有某些确切的属性,包括细胞周期蛋白CDK1、细胞周期蛋白B和CDC25水平的增加,这些蛋白的调控阈值很可能是细胞周期恢复的先决条件。此外，卵母细胞发育成熟的过程需要大量的能量,这些能量主要来自由颗粒细胞通过间隙连接转运的ATP和能量底物以及卵母细胞内丙酮酸的氧化磷酸化。缺乏丙酮酸脱氢酶的亚单位PDHIA的小鼠卵母细胞由于不能进行丙酮酸的氧化磷酸化，降低了ATP和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphateNADPH)的水平。这些卵母细胞可以生长并排卵，但不能成功地完成减数分裂。在老年妇女的卵巢中，类似的过程可能导致胚胎染色体的不分离、错误分离和非整倍体的形成。基因组印迹的重建开始于卵母细胞的生长期--直到植入前胚胎发育后才完成，由包括DNA 甲基化在内的多种机制参与调控。在缺失KDM1B(组蛋白 H3赖氨酸 -4脱甲基酶)的小鼠中发现，组蛋白甲基化也有助于母系印迹的建立。母本或父本等位基因的异常表达会导致卵母细胞或雄性生殖细胞中印迹重建过程的失败。这些基因表达的改变与几种人类遗传性疾病有关，包括 Beckwith-WiedemannPrader-Willi 和Angelman 综合征。卵母细胞中母系印迹的全部丧失会导致完全性葡萄胎的形成。

除了获得恢复减数分裂能力，生长过程中的卵母细胞逐渐获得胚胎的发育潜能，包括支持着床前的胚胎发育和发育成熟的能力，以及产生高度稳定的母体mRNA 库。在卵母细胞生长完成时，母体mRNA 库转录主动沉默，蛋白质翻译受到抑制,显著减慢直到卵母细胞成熟或受精。转录沉默需要卵母细胞与卵丘颗粒细胞通过缝隙连接进行特殊通信,并伴随大规模染色质结构的改变，这对于正在生长的卵母细胞获得恢复减数分裂和发育成熟的能力至关重要。在转录沉默后，排卵前卵母细胞中的母源蛋白和mRNA储存,除了用来支持减数分裂的恢复和受精后的第一次分裂，还包括卵母细胞质重塑精子DNA的能力和产生增强的钙振荡的能力。此外还有很多发育潜能有待进一步阐述。

(二)卵泡生长的影响因素

卵巢内一系列细胞因子作为激活剂或抑制剂在调节卵泡生长的早期阶段起关键调节作用。卵泡生长和发育的激活因子包括 LIF、碱性FGF 和kit 配体。卵泡颗粒细胞产生的kit配体和作用于卵母细胞和卵泡膜细胞上的kit受体，是卵泡生长和卵母细胞生长的启动所必需的。给新生小鼠注射抑制kit配体相互作用的kit抗体，可干扰卵泡发育的原始阶段。相反，注入重组kit配体，即扩散型和膜结合型，加速了新生大鼠卵巢从始基卵泡向初级卵泡的转变。而抗米勒管激素、激活素A和趋化因子SDF-1/CXCL12通过其受体CXCR4抑制早期卵泡生长。通过探究Gdf9敲除的小鼠和Bmp15基因纯合突变绵羊的卵巢表型发现卵母细胞来源的蛋白GDF-9和BMP-15对颗粒细胞增殖具有物种特异性。两种基因缺陷的情况下颗粒细胞大约两次加倍后都停止增殖，卵母细胞继续增长。然而，大卵母细胞最终退化，并被单层颗粒细胞包围。

1.PI3K/AKT 通路和mTOR通路磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)AKT通路和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路是目前发现的在始基卵泡的激活中起着关键作用的信号通路。当这两种通路被破坏时,都会导致小鼠卵泡生长的异常激活和始基卵泡的最终耗竭。PI3激酶催化3,4,5-磷酸肌醇磷酸盐(PIP3)磷酸化,激活蛋白激酶PDK1，而蛋白激酶PDK1又磷酸化激酶 Akt，最后导致FOXO3的磷酸化。由颗粒细胞产生的Kit配体作用于卵母细胞上表达的Kit，通过一系列的信号传导最终导致FOXO3的磷酸化和失活(从细胞核排出),导致卵泡生长启动所需的基因表达被抑制。Foxo3基因无效突变的小鼠不能抑制始基卵泡的激活，导致出生后不久始基卵泡全部激活,表现为随后的始基卵泡耗竭和卵巢早衰。

PDK1和PTEN是目前发现调节FOXO3磷酸化的主要成分。卵母细胞特异性PDK缺失导致始基卵泡耗尽从而继发不育。PTEN是PIP3磷酸酶，因此是PI3K的负调控因子。卵母细胞中PTEN的缺失，消除了对PDK1和AKT激活的抑制，也导致始基卵泡生长激活和早期卵泡耗竭。

mTOR是PI3K家族的成员，包含两个功能不同的mTOR复合体，通过下游靶点调控转录、翻译和代谢，在始基卵泡激活过程中发挥重要调控作用。此外，mTOR 通路受到TSC1/ TSC2复合物的负调控。研究显示，敲除的小鼠的卵母细胞中Tsc1和 Tsc2,虽然始基卵泡池仍能建立，但是始基卵泡被过早地激活,卵泡加速耗竭最终导致不育。而mTOR 抑制剂雷帕霉素可抑制Tsc1敲除的小鼠的卵泡激活。此外，丝氨酸/苏氨酸激酶LKB1可通过抑制 mTOR 途径来抑制始基卵泡的激活。尽管以上研究证实mTOR信号通路在卵泡生长调控中的重要性,但其上游启动因子仍待进一步阐述,具体的信号传导途径尚未阐明。

2.Hippo信号通路Hippo信号通路在抑制生长、决定器官大小和组织稳态中起关键作用。Hippo信号通路的转导途径涉及一系列蛋白激酶，包括 MST1和MST2,其通过磷酸化适配子蛋白SAV,并与之结合形成复合物，磷酸化LATS1和LATS2,后者与适配子蛋白MOB1A B结合并磷酸化转录共激活子YAP1和TAZ。磷酸化的 YAP1/TAZ保留在细胞质中。Hippo信号通路的失活导致YAP1和TAZ的低磷酸化，被转移到细胞核内，与TEAD1-4结合调节转录，导致细胞增殖和/或存活。该通路与AKT 和mTOR 通路在卵泡发育中具有相同的作用。

Hippo途径mRNA和蛋白质存在于卵巢中,随着卵泡从始基卵泡阶段进入窦状卵泡阶段,其表达量减少。在AKT激活的情况下，Hippo信号通路的失活可诱导卵泡向窦状卵泡发育。敲除Hippo通路组分编码基因的小鼠表现为生育缺陷和卵巢形态异常，包括卵巢囊肿的发生，全基因组关联分析研究发现编码YAP1的位点是PCOS候选基因之一，进一步验证Hippo通路在卵巢中的重要作用。

因此，有学者建议使用PTEN抑制剂、PI3K激活剂或mTOR激活剂对AKT、mTOR和 Hippo通路进行干预以治疗卵巢早衰。而现有的研究已经验证，通过针对上述通路药物的干预,可以实现人类和小鼠卵巢中始基卵泡的体外激活，更有研究报道了对卵巢早衰妇女卵巢组织的体外激活并进行辅助生殖获得活产胎儿的案例。

除了上述信号通路外，根据小鼠的功能基因组研究，已明确了一些在始基卵泡向初级卵泡的转变过程中起作用的转录因子，包括NOBOXSOHLH1和SOHLH2。NoboxSohlhl或 Sohlh2基因突变的小鼠在始基卵泡过渡到初级卵泡的过程中有缺陷而不育。此外，细胞周期调节因子CDKN1B在始基卵母细胞的核内起作用，以抑制卵泡的早期激活。

此外,垂体切除的动物卵巢中仍有早期卵泡的发育,提示了卵泡生长的起始不需要 FSH。在FSHβ亚基或FSH受体基因失活突变的人和小鼠中，卵泡可发育至次级卵泡和早期窦状卵泡阶段，但比FSH活性正常水平存在时更缓慢且频率显著降低。并且通过观察恒河猴胎儿垂体切除发现卵母细胞耗竭，说明了垂体衍生因子(不一定是FSH)在灵长类胎儿卵泡生长和生存中发挥重要作用。此外,对啮齿类动物卵巢的研究表明,窦前卵泡是促性腺激素的反应器官。对免疫缺陷和性腺功能低下的小鼠进行人类卵巢移植，发现FSH是超过两颗粒层阶段的卵泡生长所必需的。因此，没有促性腺激素的情况下卵泡可发育至窦前卵泡阶段,但是FSH 可能促进卵泡的生长。

卵泡的发育成熟是卵巢功能建立的基础，从始基卵泡发育成熟为优势卵泡大约要经过一年的时间。在相当长的一段时期(大约300天)中,卵泡的成长不依赖促性腺激素，卵泡的发育过程由体细胞和生殖细胞之间的旁分泌和自分泌的局部因素调控。同一批募集的卵泡在该过程中持续闭锁而减少,直至青春期在促性腺激素作用下，通过激活相关基因转录、转录后机制(包括微RNA)和蛋白质翻译后修饰的信号途径等方式促进卵泡成熟。